Endositik yolakta difteri toksini ve mutant formunun (CRM197) hücre içi trafiğiBilge Ozerman Edis1, Ebru Haciosmanoglu2, Basak Varol1, Muhammet Bektas11İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi, Biyofizik Anabilim Dalı, İstanbul
2İstanbul Bilim Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Fizyoloji Anabilim Dalı, İstanbul
GİRİŞ ve AMAÇ: Difteri toksini, AB toksinlerinden iyi karakterize edilmiş bir bakteriyel toksindir. Bununla birlikte immünolojik bir adjuvan olarak kullanılan mutant difteri toksini CRM197'nin endositik yolağı tam olarak aydınlatılmamıştır. Bu çalışmada CRM197 yüklü endozomların hücre içi trafiğini araştırmayı amaçladık.
YÖNTEM ve GEREÇLER: Hücre kültüründe endotel hücreleri (HUVEC) kullanıldı. Etkin inkübasyon süresi, toksin uygulanan hücrelerde transmisyon elektron mikroskopisi ile belirlendi. Toksin yüklü endozomal kesimleri ayrıştırmak ve saptamak için yoğunluk gradiyenti denge santrifüjü ve ADP-ribozillenme testi kullanıldı. CRM197 ile 15 dakika bekletilen endotel hücrelerinden endozomlar kesimlendi ve A fragmentinin varlığı Western blotlama ile gösterildi. CRM197 uygulanan endotel hücrelerindeki endozomların tanımlanması amacıyla immünofloresan mikroskopisi kullanıldı.
BULGULAR: Toksin uygulama süresi 15 dakika olan hücrelerde DT yüklü endozomlar genişlemiş veziküller olarak perinükleer alanda tespit edildi. DT yüklü endozomal kesim, ADP-riboziltransferaz etkinlik testi ve Western blot analizi ile tespit edildi. Sitokalasin D uygulanan aktin iskeleti hasarlı hücrelerde toksin yüklü endozomal kesimdeki enzimatik etkinliğin % 20 arttığı belirlendi. Difteri toksini ile yapılan endotel hücrelerine toksin uygulaması ve endozomal fraksiyonların elde edilme aşamaları CRM197 için tekrarlandı. CRM197 yüklü endozomal kesimde, A fragmenti yanında aktin ve Hsp90 da belirlendi. Floresan görüntülerde CRM197 yüklü endozomların aktin filamentleri ile birlikte lokalize olduğu ve plazma zarına geri dönüş sinyalini veren Rab11 peptidinin işaretlemesinin lizozomal yolağı gösteren Rab7 işaretlemesinden daha belirgin olduğu saptandı.
TARTIŞMA ve SONUÇ: Bu sonuçlar mutant difteri toksini, CRM197, yüklenmiş endozomların endositik yolakta geri dönüşüm çemberine katıldığını düşündürmektedir.
Anahtar Kelimeler: Aktin iskeleti, CRM197, Difteri toksini, Endozom, HUVEC
Intracellular trafficking of diphtheria toxin and its mutated form, CRM197, in the endocytic pathwayBilge Ozerman Edis1, Ebru Haciosmanoglu2, Basak Varol1, Muhammet Bektas11Department of Biophysics, Istanbul University, Istanbul Faculty of Medicine, Istanbul, Turkey
2Department of Physiology, Istanbul Bilim University, Faculty of Medicine, Istanbul, Turkey
INTRODUCTION: Diphtheria toxin (DTx) is a well-characterized bacterial toxin. However, the endocytic pathway of the mutant of DTx, CRM197, which is used as an immunological adjuvant, has not yet been fully explained. The aim of this study was to investigate the intracellular trafficking of CRM197-loaded endosomes.
METHODS: Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were used in a cell culture. The effective incubation time was determined by transmission electron microscopy in toxin-treated cells. Density gradient centrifugation and ADP-ribosylation assay were used to isolate and detect toxin-loaded endosomal fractions. Endosomal fractions from CRM197-treated cells were elicited after 15 minutes of incubation and the presence of fragment A was demonstrated using Western blot. Immunofluorescence microscopy was used to identify endosomes in CRM197-treated endothelial cells.
RESULTS: DTx-loaded endosomes were detected as enlarged vesicles in the perinuclear area with 15 minutes of toxin treatment. DTx-loaded endosomal fractions were determined by ADP-ribosyltransferase activity test and Western blot analysis. Enzymatic activity of the toxin-loaded endosomal fraction increased by 20% in actin cytoskeletal-damaged cells treated with cytochalasin D. The steps for the toxin treatment of HUVECs with DTx and obtaining endosomal fractions were repeated for CRM197. In the CRM197-loaded endosomal fraction, actin and Hsp90 were identified in addition to fragment A. Fluorescent images revealed that CRM197-loaded endosomes were co-localized with actin filaments and that Rab11, which signals the return to the plasma membrane, was more prominent than Rab7, the lysosomal pathway indicator.
DISCUSSION AND CONCLUSION: These results suggest that CRM197-loaded endosomes participate in the recycling pathway.
Keywords: Actin cytoskeleton, CRM197; diphtheria toxin; endosome; Human umbilical vein endothelial cells.
Bilge Ozerman Edis, Ebru Haciosmanoglu, Basak Varol, Muhammet Bektas. Intracellular trafficking of diphtheria toxin and its mutated form, CRM197, in the endocytic pathway. North Clin Istanb. 2018; 5(2): 89-95
Sorumlu Yazar: Bilge Ozerman Edis, Türkiye |
|
Tam Metin PDF
Yazdır
Alıntıyı İndir
RIS
E-Postala
Paylaş
Yazara e-posta gönder
PubMed